雷晓晨肠道宏蛋白质组学揭示1型糖尿病危险人群的宿主微生物相互作用-DC糖医时讯

雷晓晨
Patrick G. Gavin,1 Jane A. Mullaney,Dorothy Loo,Kim-Anh L?e Cao,Peter A. Gottlieb,Michelle M. Hill,Danny Zipris,Emma E. Hamilton-Williams
本刊负责人：雷闽湘　中南大学湘雅医院
审校：孙　嘉　珠江医院
翻译：劳美铃　佛山市第一医院
摘要
目的
肠道菌群失调与1型糖尿病的发病机制有关，但其对宿主的功能影响尚不清楚。我们研究了与1型糖尿病风险相关的微生物和宿主之间的相互作用。
研究设计与方法
应该是对33例T1DM、17例自身抗体阳性、29例低风险自身抗体阴性、22例健康者的粪便样本进行横断面分析。用宏蛋白组学（Metaproteomic）分析鉴定肠道和胰腺来源的宿主蛋白和微生物蛋白，并将这些数据与基于测序的微生物菌群谱相结合。
研究结果
人体（宿主来源的）蛋白和微生物源蛋白均可用以将新发糖尿病和胰岛自身抗体阳性者与低风险者进行区分。与胰腺外分泌功能、炎症反应和肠道黏膜功能相关的宿主蛋白的流行表型有显著改变。整合分析表明，微生物群与维持粘膜屏障功能、微绒毛粘附及新发1型糖尿病患者胰腺外分泌功能丧失的宿主蛋白相关。

结论
这些数据证实了1型糖尿病患者肠道炎症的增加和屏障功能的降低。他们的研究同时证明了1型糖尿病患者会发生胰腺外分泌功能障碍，且首次发现在高风险个体人群中，他们在发病前即存在这种功能障碍。该数据确定了一种独特的与1型糖尿病相关的大便特征，可作为监测疾病进展或对旨在恢复健康微生物群的疗法的反应的一种手段。
1型糖尿病由T细胞介导的对胰岛素分泌细胞的破坏引起，并同时受遗传易感性和环境的影响。肠道菌群失调在许多免疫介导性疾病的发病机制中起重要作用，包括1型糖尿病[1]。肠道微生物群的组成是由遗传和环境因素共同决定的，例如饮食和卫生[2、3]。环境因素，如婴儿喂食和接触微生物制剂已与1型糖尿病的风险有关[4]。肠道菌群的变化如何改变1型糖尿病患者的肠道环境和免疫功能尚不清楚。
在不同的研究发现中还没有就1型糖尿病相关微生物的构成达成明确的共识[5]。肠道菌群失调被认为会在疾病发生前加重肠道炎症反应。有证据表明，存在胰岛自身免疫的个体肠道通透性增加[6]，对1型糖尿病患者十二指肠活检标本的研究发现，其炎症反应较轻微[7、8]。需要了解肠道微生物的功能特性以及肠道微生物与宿主之间的相互作用，以便深入了解肠道微生物在1型糖尿病发展中的作用。粪便蛋白质的宏蛋白质组学是一种相对较新的方法，它超越了对微生物的成分分析，提供了一种非侵入性的方法来分析肠道功能和检查宿主微生物之间的关系[9]。
在本研究中，我们对101名个体进行了一次宏蛋白分析，其中包括新发1型糖尿病患者、高或低风险直系亲属(FDRs)，以及健康对照者。我们已经发现了与上皮屏障功能相关的人和微生物粪便蛋白网络，以及外分泌胰腺，这些蛋白在新发1型糖尿病患者和具有持续胰岛自身免疫的高危个体中都受到干扰，并将这些变化与特定的微生物分类群联系起来。
研究设计与方法
研究对象的一般特征
所有受试者都住在科罗拉多州丹佛市。如上文所述，在家中或芭芭拉·戴维斯糖尿病中心收集粪便样本[10]。在家中采集的样品在被送到研究中心之前，存放在-20摄氏度。排除有胃肠道疾病或已知感染的人，或在4周前服用抗生素的人。受试者特征归纳在表1中。研究对象包括新诊断的1型糖尿病患者(6个月以内新发病患者)，他们在访问芭芭拉戴维斯儿童糖尿病中心时被招募。有1~4种自身抗体和直系亲属血清阴性的1型糖尿病患者是通过1型糖尿病试验网途径招募到预防研究中的。没有任何自身免疫性疾病家族史的受试者是从美国科罗拉多州大学招聘员工中和健康儿童中招募来的。3名血清阴性者和1名血清阳性者是素食主义者，1名血清阴性者、1名血清阳性者和2名新发病患者食用无麸质饮食。所有受试者都根据科罗拉多丹佛大学机构审查委员会批准的研究协议给予了知情同意。这项研究被批准为一项辅助研究，由1型糖尿病试验网批准。

蛋白质提取与消化
样品离心前在含蛋白酶抑制剂的磷酸钾缓冲液(苯基甲基松果醇、亮肽酶、抑肽酶)中重新悬浮，去除沉渣。用肽N- 糖苷酶F(普罗米加，麦迪逊，WI)对上清液中总蛋白进行脱糖。用转基因猪胰蛋白酶(普罗米加)对蛋白质进行增溶、还原和烷基化处理，然后进行消化。洗涤剂被沉淀和使用C18尖端去除盐类 (糖原，哥伦比亚，MD)。用0.1%甲酸对胰蛋白酶进行质谱分析。
质谱分析
利用胰蛋白酶肽对Q萃取质谱进行液相色谱-串联质谱分析(Thermo Fisher Scienti?c, Waltham, MA).肽类在简易喷雾分析柱上被分离(Thermo Fisher Scienti?c)。90分钟梯度的3%-25%乙腈作用在60min以上，其次为25-40%乙腈作用超过12min，以250nL/min的流速加入0.1%甲酸的95%乙腈则为15min。从电荷/质量比350-1，400中获得测量质谱扫描(Thermo Fisher Scienti?c)，分辨率r=70，自动增益控制为3106，最大注入时间为100ms。选择前20强离子进行串联质谱分析，归一化碰撞能量为29%。启用了30秒的动态排除，质量排除宽度为百万分之十。质谱的第二阶段为质量/电荷比为200~2,000，分辨率r=17,500，自动增益控制为5*105，最大进样时间为55ms。
数据库检索与处理
肽谱匹配、蛋白质推断、分组和定量采用MetaPro-IQ策略[11]，例外情况如下。X！利用rTANDEM实现了串联算法，用光谱磨(Agilent，Santa Clara，CA)实现了终末数据库搜索。在末次搜索中，半胱氨酸的卡波酰胺甲基化反应被认为是一种固定的修饰模式包含在内。蛋氨酸的氧化和天冬酰胺的脱酰胺被认为是可变的修饰模式。最多允许两次缺失的缝隙。利用错误发现率为0.01的反向搜索数据库编制了诱饵数据库。共享一个或多个肽的蛋白质被分组。只有一个被检测到的肽的蛋白质被去除。一份被确认含有小于500个蛋白质的样本和1个离群点，根据很高的人类/微生物蛋白存在比率(超过平均值的8个标准差以上) (补充见图1)被排除在外。原始光谱、峰表、自定义序列数据库和量化的结果已与识别符PXD 008870一起存放在PRIDE(量化的蛋白质组学)匹配存储库中。
微生物群分析
用16S rRNA基因测序法测定了大便细菌的丰度，并对其进行了描述[10]。
统计分析
单因素和多因素分析显示，在任何一组受试者中，超过40%的人检测到了蛋白质。所有检测到的蛋白质都用于功能通路的分配。人类和非人类蛋白质分别被定义为人类总强度和非人类总强度之和。蛋白质强度通过常量对数比变换归一化，其偏移量与整个数据集中检测到的强度相对应。经年龄、性别调整后进行单因素方差分析。用本雅明和霍奇伯格法修正多重假设。校正后P<0.05的蛋白质进一步通过临时图基测试进行研究。
采用监督稀疏偏最小二乘判别分析(sPLS-DA)和混合Omics R软件包[12]建立了监督多元模型。用R和100,000序列中的纯素包的置换变异方差分析(PERMANOVA)评价各组间的差异。建立了广义线性模型，使用具有最低单变量P值的10个蛋白质(对照组和血清阴性患者组与新发病患者组)，并使用弃一法交叉验证对其进行了评估。蛋白质组学和16S rRNA测序数据的整合利用DIABLO进行混合组学，其值在设计矩阵[12]中为0.5。相关性关联网络是在细胞角中绘制的。利用R. KEGG正交图(KO)进行Pearson相关和层次聚类，从人肠道微生物组的综合参考目录()中检索微生物蛋白质的分配。共享KO的蛋白质强度被相加，然后归一化，再组合，并以与单个蛋白质相同的方式进行评估。KOs被分配到肠道代谢模块(GMMS)，并使用GOmixer[13]进行评估。用Unipept[14]确定了每个肽的最后一个共同祖先。

研究结果
粪便样品的宏蛋白组分析
我们使用粪便蛋白质的宏蛋白组学来验证肠道炎症与1型糖尿病的进展有关的假说，并确定胰岛自身免疫或临床疾病患者是否改变了微生物的功能特征。因此，我们分析了可溶解的粪便蛋白质，这些蛋白质对人类蛋白质有富集作用，但同时也含有可溶性微生物蛋白。四组受试者包括新发患者、血清阳性个体、血清阴性FDRs和不相关的健康对照者(表1)。被确认共有470个人蛋白簇和10,908个非人类蛋白簇，每个粪便样品平均有1,566±305个蛋白质簇。虽然人类蛋白质的比例较小，但人类来源的蛋白质占总强度的52±22%。各组间人蛋白和微生物蛋白的总数量以及人与细菌蛋白强度的比例均无显著性差异(P>0.05)(补充见图1)。经多次检测调整后，没有个体蛋白与年龄或性别有明显的相关性。然后，我们研究了在有和没有持续胰岛自身免疫的个体之间，特异蛋白的丰度是否存在差异。
胰岛自身免疫个体与低风险及健康个体粪便蛋白的多因素分析
sPLS-DA被用来鉴别可能区分这四组研究人群的蛋白质[15]。分析表明，健康对照者与血清阴性个体重叠，而新发患者和血清阳性者则与这些人群分离(补充见图2A)。统计学比较发现，尽管四组受试者总体上存在差异(P=0.014)，但健康对照组与血清阴性组无显着性差异(P=0.08)。在此基础上，我们将健康对照组和血清阴性组集合在一起，以增强对低风险个体胰岛自身免疫状态下个体差异的检测能力。这三组受试者的sPLD-DA将大多数新发患者聚集在成分1上，而血清阳性组与对照组在成分1和2上均分离(图1A)(PERMANOVAP=0.0048)。微生物和人类的蛋白质都有助于分离这三组受试者(图1B)。双向sPLD-DA显示，所有新发患者和几乎所有血清阳性个体都能从对照组中分离出来(P=0.036和P=0.021)(补充图2B和C)。因此，粪便宏蛋白组能够区分具有胰岛自身免疫功能的个体和低风险健康个体。
在不同受试人群的粪便中个体蛋白的编码验证
我们接下来评估个体人类蛋白质是否区分疾病患者或胰岛自身抗体阳性者与对照组。用单因素方差分析(补充见表1)对新发、血清阳性和联合对照组进行比较，经多次试验校正后得出24种蛋白，具有7种特征且P<0.05(半乳凝素-3、纤维蛋白-1、CUZD 1、中性神经酰胺酶、CELA3A、CLCA 1和IGHA 1)(图1C)。新发患者中半乳凝素-3和纤维蛋白-1水平升高，而新发患者和/或血清阳性者中无论是CUZD 1、中性神经酰胺酶、CLA3A、CLCA1和IGHA 1水平均低于正常对照组(P<0.0 5)。sPLS-DA分析显示仅利用人类蛋白或可将三个研究组别区分(P=0.007)(如图1D所示)。差异丰富的蛋白质包括胰外分泌所产生的3种蛋白质(CELA3A, CUZD1, and中性神经酰胺酶)。CELA3A蛋白与高度同源的CELA3B结合在一起，两者均被称为胰弹性蛋白酶1。其他差异丰富的蛋白参与了IgA抗体的产生(IGHA1)、炎症反应和中性粒细胞的活化(半乳凝素-3)、细胞外基质(纤维蛋白-1)、肿瘤生长因子-β(TGF-β)的生物利用度(纤维蛋白-1)和杯状细胞粘液的产生(CLCA 1)。这些观察证实了其他的一些研究成果，即1型糖尿病患者个体的胰腺外分泌输出减少[16]。目前研究表明，我们第一印象中，外分泌酶的减少是从胰岛自身抗体阳性个体开始的。新发患者中的半乳凝素-3和纤维蛋白-1的丰度增加，这就提出了一种假设，即在1型糖尿病患者中，与炎症反应相关的蛋白质会释放到大便中。
胰岛自身抗体阳性个体的粪便微生物蛋白的编码验证
自身免疫
接下来，我们为与1型糖尿病相关的单个微生物蛋白进行了编码。虽然有34种蛋白的P值<0.01和143种蛋白的P值<0.05，但没有一种蛋白经多次检测校正后有统计学差异(补充见表2)。如补充的图3所示，其中5种微生物蛋白的p值为未经校正最低值（P<0.001）。这5种蛋白质的KO分布为磷酸转移酶系统、糖精特异酶IIA组分[EC：2.7.1.-]、伸长因子热不稳定蛋白、碱性膜蛋白A及相关蛋白、未分配蛋白和铁氧还蛋白氢酶[EC：1.12.7.2]。这5种蛋白质的分类为：前福卡利杆菌、梭状菌和未分类菌。虽然单个微生物蛋白不能显著地区分各受试组患者，但使用微生物蛋白的多变量sPLS-DA只能分离新发、血清阳性和对照组患者(P=0.007)(图1E)。这些结果表明，细菌衍生蛋白与正常人的胰岛自身免疫有着共同的区别。
大便代谢蛋白组的功能改变可能与胰岛自身免疫有关
为了探讨与微生物蛋白相关的生物学途径，我们用KO法折叠了微生物蛋白。然而，三分之一已编码的微生物蛋白，在所代表的545个KO中，没有指定的KO，在调整多项测试后，各组之间没有明显的差异(补充表3)。sPLS-DA显示，KO驱动接近于区分受试组患者(P=0.06)(补充图4)。作为一种替代的方法，GOmixer软件包被用来推断与已编码微生物蛋白质相关的GMMs。新发患者与联合对照组的比较显示，新发患者黏液降解增加(P=0.02)。血清阳性个体与联合对照组的比较表明，5个GMMs有统计学意义，P值<0.05，包括通过转移酶产生丁酸(P=0.023)，而在血清阳性个体中，这一比例有所下降。所有已被确认的GMMs在补充表4中列出。虽然这些差异在经过多次试验校正后均无显着性差异，但表明具有胰岛自身免疫功能的个体粘蛋白降解和丁酸生成可能发生改变。
整合网络分析：差异表达蛋白与疾病风险相关的细菌类群之间的相关性
接下来，我们进行了一项综合分析，探讨人类和微生物蛋白质与细菌分类群之间的相关性，利用新开发的DIABLO方法，最能区分每一受试组患者与数据库中其他高度相关的特征[12]。细菌类群的丰度是通过16S rRNA基因序列分析[10]确定的。我们首先将联合对照组患者与新发患者进行比较，选择的特征和相似性评分被用来生成一个在网络图中可视化的相似矩阵(图2A)。通过分析分为三个蛋白簇，由普氏菌属驱动的第一蛋白簇与类杆菌和人类蛋白质簇呈负相关，包括粘附分子CDHR 5和CDH 1，刷缘酶MGAM和NAALADL1。第二蛋白簇由理研菌科驱动，理研菌科与粘蛋白MUC2和FCGBP、粘附分子CEACAM5和一组外分泌胰生成蛋白簇(CUZD1、CELA3A、GP2和中性神经酰胺酶)呈正相关，与纤维蛋白-1和一群重链和轻链抗体可变区呈负相关。因为与新发病的患者相比，血清阴性的个体中理研菌科菌的含量更高[10]，这些数据表明理研菌科菌或许促进粘液的产生和健康上皮屏障的存在，而在新发患者中大量存在的某些特异性抗体的存在可能会阻遏这种相互作用。
然后，我们通过将联合对照患者与血清阳性个体进行比较，重复了DIABLO分析，形成了两个蛋白簇(图2B)。第一蛋白簇同样含有普氏菌属，与类杆菌、杯状细胞产生的CLCA 1和两个抗体组分呈负相关。第二蛋白簇将一个组含MUC 2和梭菌的F.prausnitzii-衍生蛋白连接起来（F.prausnitzii是定植于哺乳动物胃肠道中的共生菌）。该簇与粘附分子CDHR 5、刷缘酶MGAM和NAALADL 1呈正相关。此外，MUC 2还与链球菌相关，与粘附分子CDHR 2和CEACAM 5和胰腺蛋白CELA3A、CUZD 1、GP2和DPEP 1呈正相关。这些数据表明，在正常人中，显著增加蛋白质(如CELA3A，CUZD 1)与肠道健康有关的蛋白质和分类菌群，如MUC 2和F.prusnitzii呈正相关[17]。
接下来，我们使用所有受试组患者的数据，为在两个DIABLO网络中选择的每对蛋白质或分类菌群，计算出它们的Pearson相关系数，并使用层次聚类对这些数据进行分组(补充图5)。这一聚类分析清楚地划分了三个主要类群：1)普氏菌属，2)理研菌科菌和F.prausnitzii，3)类杆菌。这表明理研菌科菌和F.prausnitzii菌属蛋白均与粘蛋白层组成、粘附分子和外分泌胰腺衍生蛋白呈正相关，表明这些分类群可能占据着相似的生态功能作用。我们从这些数据中得出结论，健康对照组患者和血清阴性个体中增加的蛋白质和分类群与抗炎作用和屏障功能有关的功能和分类群相关。
粪便蛋白作为生物标志物的诊断性能评价
最后，我们评估了前10位差异丰富的蛋白质是如何作为潜在的生物标志物的。通过使用对照组患者与新发患者的关系建立了一个通用的线性模型。受试者工作特征曲线（ROC）分析与弃一法交叉验证得出曲线下面积为0.85(图3A)。我们使用该模型预测血清阳性个体被识别为新发糖尿病的概率(图3B)，并发现血清阳性个体比血清阴性或健康对照者更有可能成为新发病患者(P<0.001)。我们的模型没有显示新发患者与其性别(P=0.22)或HbA1c相关(P=0.968)，表明不太可能是由血糖异常引起的。值得注意的是，新发患者与年龄呈显著负相关(补充图6A)。然而，如果排除较年龄较大的受试者，则失去了与年龄的相关性(补充图6B)，但该模型仍能显著区分各受试组(补充图6C)。这些结果表明粪便蛋白信号在1型糖尿病风险分层中的潜在诊断价值，并进一步提示肠道/粪便蛋白参与疾病的进展。

结论
我们使用宏蛋白质组学对与1型糖尿病相关的人类和微生物粪便蛋白进行了功能表征，这是我们所知道的同类研究中规模最大的一次。我们做了以下观察：1)粪便中存在的人和微生物蛋白能够区分胰岛自身免疫阳性的个体与低风险和健康的个体；2)新发糖尿病患者和胰岛抗体阳性个体与对照组相比，胰腺外分泌输出标记物减少；3)新发1型糖尿病患者粪便中与炎症反应有关的蛋白质大量增加；4)蛋白质与细菌分类群之间存在着功能关系，而在具有黏膜屏障功能和胰腺外分泌输出的新发患者和血清阳性个体中的这种功能关系是减弱的。
在显著改变的人类蛋白质中，有几种已知的免疫调节功能。纤维蛋白-1构成细胞外基质微纤维的关键组成部分，它储存潜在的转化生长因子-β，降低转化生长因子-β的活性和信号[18]。由于调节性T细胞在肠内的诱导是依赖于转化生长因子-β的[19]，增加的纤维蛋白-1可能会降低调节T-细胞的频率，此外，纤维蛋白-1在巨噬细胞趋化性中起着一定的作用[20]。在广泛的与炎症相关的疾病[21]中，半乳凝素-3被认为是一种炎症介质，并通过活性氧的产生在炎症细胞中起趋化作用[22]。这些蛋白质的过度生产支持了我们的假设，即肠道炎症的增加与1型糖尿病的发病有关。然而，这些炎症蛋白的来源是未知的，可能是来源于肠道或胰腺。粪便炎症标记物——钙卫蛋白（包括S100A8和S100A9）的丰度没有改变。钙卫蛋白是由活化的中性粒细胞产生的(例如，在活动性炎症性肠道疾病中)。1型糖尿病患者十二指肠和空肠活检标本的研究中已报道其有轻微肠道炎症反应[7、23]。这包括HLAⅡ类的高表达，上皮细胞中的ICAM-1，固有层的白介素1α和-4的过度表达[7]，巨噬细胞和单核细胞的渗入增加[8]。1型糖尿病肠道中未见中性粒细胞浓度的增加，这可能解释了钙卫蛋白的稳定性。对1型糖尿病患者回肠或结肠活检标本的研究尚未见报道；因此，这些组织中是否参与炎症反应的研究尚不清楚。虽然IGHA 1(IgA 1重链常数区)在血清阳性个体中减少，但有几个Ig可变区导致各组间的差异。一些研究报告说，1型糖尿病患者粪便IgA水平较低[24]，而其他研究则没有发现差异[25、26]。正如其他研究报道，可溶性IgA水平的降低可能表明IgA增加了细菌的包膜[27]。另外，IgA水平的降低可能与高风险人群临床疾病发病前细菌多样性的减少有关[28]。
除免疫调节蛋白外，新发患者和血清阳性个体的胰腺外分泌蛋白也减少。超声显像和粪便胰弹性蛋白酶-1检测发现1型糖尿病患者胰腺外分泌功能的缺陷[16、29]。与我们发现相一致，粪便弹性蛋白酶在新发患者中被报告为下降，并且随着疾病持续时间的延长而持续下降[29]。粪弹性蛋白酶与C肽呈正相关，与HbA1c呈负相关[29]。我们对胰岛抗体阳性个体粪便弹性蛋白酶的分析表明，外分泌功能障碍的过程在诊断前就开始了。胰腺外分泌功能障碍的原因尚不清楚，并提出了多项假设[16]。研究表明，免疫参与胰腺外分泌功能异常的可能作用[30]。值得注意的是，我们的综合分析表明，1型糖尿病患者减少的胰腺外分泌功能与肠道微生物之间存在着某种关系。
多因素综合分析发现，胰腺外分泌蛋白的丰度增加与正常上皮屏障相关蛋白(如MUC 2、FCGBP、CDHR 5、CDH 1)[31、32]和理研菌科有关，而理研菌科在血清阴性个体中明显增加[10]。这个与健康相关的菌群簇包括产丁酸盐的F.prausnitzii菌和梭状芽胞菌，正如理研菌科、瘤胃球菌、Barnesiella菌（肠道一种厌氧菌，有害细菌）和Dorea菌。结肠微生物产丁酸酯具有多种有利效应[33]。最近对3,048组数据进行的Meta分析发现，Barnesiella菌属和理研菌科菌属普遍与健康相关[34]。
在不利于健康的相关簇群中包括有多形杆菌属和普氏菌属相关的簇。几项研究报告，在胰岛自身抗体阳性个体或疾病发病前后，多形杆菌种类增加[26、35、36]。众所周知，在素食个体中，普氏菌属占主导地位，而多形杆菌则与高脂肪、高蛋白的西方饮食有关[3]。尽管普氏菌属与以植物为基础的饮食有关联，但许多研究发现，在炎症性疾病中，普氏菌属菌种的数量有所增加[37]。这些看似矛盾的研究发现可能是由于普氏菌属菌种的巨大多样性所致。目前的分析并不支持普氏菌属在预防胰岛自身免疫或1型糖尿病进展中的保护作用。
血清阳性个体可以根据胰岛自身抗体的数量和血糖异常情况划分为疾病的不同分期[38]。1期是具有两个或两个以上的自身抗体，2期是具有两个或两个以上的自身抗体和血糖异常，3期是高血糖。在本研究的17例血清阳性个体中，其中3例具有1个自身抗体，属于1期，但其中1例存在血糖异常，因此并不能用此方法对其进行分期，而另3例属于2期。由于数量较少，我们无法确定我们的模型是否与疾病分期有关。需要进行纵向研究，以确定粪便中的蛋白质是否可以预测疾病的进展。
虽然我们在样本中检测到了一个显著的疾病相关特征，但蛋白质丰度的差异需要在一个更大的独立队列中得到验证。此外，我们没有检测C肽，因此我们无法将β细胞功能与粪便蛋白进行关联。 “鸟枪法”定量蛋白质组学技术由于缺乏检测低丰度蛋白质的敏感性和相对于其他方法的低重现性而受到限制。因此，我们观察到的变化应该用其他方法来验证。在其他研究[39、40]中，1型糖尿病患者的CUZD 1和CELA3A减少，这表明目前的研究成果是可复制的。另一个限制是我们只分析了可溶性粪便蛋白。虽然这一分析结果是人类蛋白质的富集，但它将微生物蛋白质的检测偏向于那些从易溶解的细菌(如革兰氏阴性菌)中分泌或释放出来的蛋白质。此外，许多已被编码的细菌蛋白都没有特征，不能包括在我们的功能分析中。我们的研究对象年龄范围比较广。因为疾病的发病机制在儿童和成人之间是不同的，所以必须在这些人群中分别验证我们的研究发现。我们也没有收集关于饮食摄入的详细信息，这可能是我们的数据中的一个额外的混杂因素。
尽管排除了这些限制因素，我们还是能够描述肠道、胰腺和微生物衍生的与1型糖尿病相关的蛋白质之间的新关联。这些研究确认了特异粪便抗体的存在与肠道健康相关的分类菌群之间的负相关，并证明了胰腺外分泌蛋白丰度和抗炎微生物菌群与黏膜屏障功能之间的相关性。本研究首次建立了利用粪便宏蛋白质组学将肠道微生物菌群的变化与1型糖尿病患者的肠道粘膜和胰腺外分泌的健康联系起来。
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